鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感

新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗(La Sota株+
M41株+Z16株+HP株)由河南农业大学、辽宁益康生物制品有限公司、上海海利生物药品有限公司联合研制,用于预防鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、H9亚型禽流感,该疫苗于2009年4月2日,被农业部批准为国家三类新兽药,证书编号为新兽药证字12号,批准文号为:兽药生字
060132142。

新城疫(New Castle
due∞e),是由副粘病毒属的新城疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,其发病后主要特征是呼吸困难、下痢、粘膜和浆膜出血,病程稍长的伴有神经症状,成鸡严重产蛋下降。雏鸡比成年鸡易感性更高,并导致较高的发病率与死亡率⋯,危害极大,是目前对全世界养禽业威胁最大的传染性疾病之一。目前尚无有效治疗鸡新城疫的药物,免疫预防是控制鸡新城疫的实用、有效手段。鸡新城疫免疫受到诸多因素的影响而效果不同,母源抗体就是其中一个重要因素。母源抗体可在一定时间内使雏鸡得到被动保护,抵御疾病感染,但由于其对疫苗抗原有中和、清除等作用,会不同程度地干扰疫苗的免疫效果。因此,母源抗体在初生家禽体内的变化规律,对免疫程序的制定和疫苗的应用至关重要。首免过早,会因母源抗体水平过高而导致免疫失败,过迟则雏鸡又会因母源抗体水平过低而受新城疫的侵袭。本试验选择了江苏某规模化养鸡场,运用血凝一血凝抑制试验对雏鸡血清中新城疫母源抗体水平进行抽样检测,分析其变化规律,为制定科学合理的免疫程序提供技术支持。1.
材料与方法1.1 材料
1.1.1
试剂鸡新城疫病毒血凝一血凝抑制反应相关试剂,由南京市畜牧兽医站提供。1.1.2
试验动物同一批次蛋雏鸡5000羽,来源于开产3个月的蛋鸡群,由江苏某规模化蛋鸡场提供。保持相同饲养环境,随机抽取l、3、5、7、9、1l、13日龄雏鸡各30羽待检。其父母代按如下免疫程序进行多次免疫:4日龄,饮水免疫鸡新城疫一传染性支气管炎二联活疫苗;25
13龄饮水免疫鸡新城疫一传染性支气管炎二联活疫苗;6013龄和90
13龄先后饮水免疫鸡新城疫活疫苗;120日龄肌肉注射接种鸡新城疫一传染性支气管炎一减蛋综合征三联灭活疫苗。1.2
方法
1.2.1
样品采集雏鸡分别于1、3、5、7、9、11、13日龄采血,分离血清待测。1.2.2抗体检测采用血凝一血凝抑制试验技术,按照国标《新城疫诊断技术》所规定的方法操作,以检测不同Et龄蛋雏鸡的抗体效价。同时按常规方法设置阴性和阳性对照。1.2.3
结果判定以100%抑制凝集的血清最大稀释度为该份血清样品的抗体效价;根据抗体水平低于51092时保护力很差,容易感染新城疫病毒而发病的基本理论,本试验把抗体水平51092作为保护临界值来评价免疫效果,当鸡HI抗体水平低于51092时,免疫效力低下,判断为免疫不合格;当HI抗体水平高于51092时,免疫效力良好,判断为免疫合格。2.
结果
2.1
蛋雏鸡母源抗体检测结果本试验共检测了210份雏鸡血清样品,如表1所示。新城疫母源抗体检测结果显示蛋雏鸡新城疫母源抗体水平在3日龄时平均效价最高,在13日龄时其新城疫母源抗体平均效价最低。其中抗体效价≥51092的羽数占总检测鸡群的91.4%2.2蛋雏鸡新城疫母源抗体消长规律随日龄的增长,蛋雏鸡新城疫母源抗体消长曲线蛋雏鸡新城疫母源抗体水平在3日龄时平均效价最高,在7日龄后抗体水平出现下降,在13日龄时其新城疫母源抗体平均效价下降至51092以下,1~9日龄雏鸡的新城疫母源抗体水平均较高。3.
讨论
3.1
鸡新城疫母源抗体整体水平通过对新城疫母源抗体水平监测,对该鸡场的免疫情况有了初步了解,新城疫母源抗体持续期为12d,母源抗体效价在3~101092范围内,整体水平较高,在l~11日龄时抗体效价均已达到合格标准,对蛋雏鸡有较高的免疫保护力。3.2鸡新城疫母源抗体随雏鸡日龄变化检测结果显示,新城疫母源抗体效价随着雏鸡日龄的增长而呈缓慢下降趋势。已接种新城疫疫苗的母鸡,其体内的免疫抗体能够通过卵黄囊传递给雏鸡,而使雏鸡产生被动免疫力,1日龄雏鸡母源抗体水平已高于保护临界值,由于雏鸡获得母源抗体是通过卵黄的吸收实现的,而雏鸡对卵黄的吸收有一定过程,因此在3—5日龄时雏鸡的母源抗体水平较1日龄时有所上升,母源抗体水平从7日龄开始下降,直到13日龄时抗体效价降至保护临界值以下,此时母源抗体水平已达不到保护力。3.3
鸡新城疫母源抗体监测结果与其它报道的异同许多学者对新城疫母源抗体的消长规律进行了相关研究,其变化趋势主要有下坡势、单峰势和双峰势3类3.4鸡新城疫首免日龄的推定母源抗体水平在很大程度上影响着疫苗首免的效果,如果为止早期感染新城疫就盲目进行超前免疫,在母源抗体水平较高时进行首免,免疫后机体会受母源抗体的干扰,抑制体内抗体的产生,反而达不到免疫效果;如果在雏鸡母源抗体水平较低时再进行首免,此时雏鸡已出现了免疫空白,极易感染新城疫病毒。因此,从本次试验来看,对于该规模化蛋鸡场,建议新城疫疫苗首免时间安排在11~13日龄为宜,既可避开母源抗体的高峰期,又不会迟于母源抗体低于保护的临界值。

  1. 材料与方法

表2 新城疫效力检验结果

禽流感流行毒株攻毒验证试验
按照农业部兽用新生物制品管理办法的要求,在疫苗的安全检验、物理性状检验、无菌检验、效力检验等各项检验均符合质量标准的要求基础上,将3批疫苗送中国兽医药品监察所进行禽流感流行毒株攻毒验证试验,结果,3批疫苗对国家禽流感参考实验室提供的流行毒株的攻毒保护率在80%以上。

1.2 方法

14日龄非免疫雏鸡由本所实验鸡场提供。

临床安全试验
在国内不同地区对不同年龄、性别、品种的鸡进行免疫接种,共接种10万余羽份,在不同地点随机抽样进行安全性观察。

2.2蛋雏鸡新城疫母源抗体消长规律随日龄的增长,蛋雏鸡新城疫母源抗体消长曲线蛋雏鸡新城疫母源抗体水平在3日龄时平均效价最高,在7日龄后抗体水平出现下降,在13日龄时其新城疫母源抗体平均效价下降至51092以下,1~9日龄雏鸡的新城疫母源抗体水平均较高。

疫苗的安全检验
通过14天的观察,用10个使用剂量的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗免疫的30只雏鸡生长发育良好、精神状况、饮食欲等均无异常表现。

疫苗的免疫期
测定实验室试制的3批疫苗的免疫期,证明该四联苗对28日龄以上易感雏鸡免疫后,3个月内可抵抗强毒的攻击,新城疫、禽流感、减蛋综合征、传染性支气管炎抗体可保持在7㏒2水平;对成鸡免疫后4个月,新城疫HI>9.1Log2,传染性支气管炎ELISA
P/N>2.6,减蛋综合征HI>8.9Log2,禽流感HI>7.9Log2,免疫后4个月均可保护鸡群耐过强毒的攻击。?

鸡新城疫,是由副粘病毒属的新城疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,其发病后主要特征是呼吸困难、下痢、粘膜和浆膜出血,病程稍长的伴有神经症状,成鸡严重产蛋下降。雏鸡比成年鸡易感性更高,并导致较高的发病率与死亡率?,危害极大,是目前对全世界养禽业威胁最大的传染性疾病之一。目前尚无有效治疗鸡新城疫的药物,免疫预防是控制鸡新城疫的实用、有效手段。鸡新城疫免疫受到诸多因素的影响而效果不同,母源抗体就是其中一个重要因素。母源抗体可在一定时间内使雏鸡得到被动保护,抵御疾病感染,但由于其对疫苗抗原有中和、清除等作用,会不同程度地干扰疫苗的免疫效果。因此,母源抗体在初生家禽体内的变化规律,对免疫程序的制定和疫苗的应用至关重要。首免过早,会因母源抗体水平过高而导致免疫失败,过迟则雏鸡又会因母源抗体水平过低而受新城疫的侵袭。本试验选择了江苏某规模化养鸡场,运用血凝一血凝抑制试验对雏鸡血清中新城疫母源抗体水平进行抽样检测,分析其变化规律,为制定科学合理的免疫程序提供技术支持。

无菌检验
每批冻干疫苗随机抽取4支,用灭菌生理盐水稀释至原量,混合后接种硫乙醇酸盐培养基斜面各2支,每支0.2毫升,一支置36±1℃培养;一支置25±1℃培养,另设生理盐水和空白对照管,观察3~5天。

通用名:鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗(La
Sota株+M41株+Z16株+HP株)

1.1 材料

剩余水分含量测定
采用真空烘干法,测定前,先将洗净干燥的称量瓶,置150℃干燥箱烘干2小时,放氯化钙罐中冷却后称重。迅速打开真空良好的疫苗瓶,将制品倒入称量瓶内盖好,在天平上称量。每批做4个样品,立即将称量瓶置于有P2O5的真空干燥箱中,打开瓶盖,抽真空加热干燥3小时。然后通入经过氯化钙吸水的干燥空气,待真空干燥箱温度稍下降后,打开箱门,迅速盖好称量瓶盖,将所有称量瓶移入有氯化钙的干燥罐中,冷却至室温时称重,然后再移回到真空干燥箱内继续烘干3小时,两次烘干达到恒量,减失的重量即为含水量。

单剂量重复安全试验
选择3批疫苗随机抽取样品后,每批分别颈部皮下和胸肌肌肉注射接种0.5毫升于14日龄SPF鸡20只,同时取5只不接种作为对照组,各组别接种后分别置于负压隔离器内饲养,14天后加强另侧胸肌肌肉注射免疫一次,接种剂量为1羽份。继续观察试验鸡只饮食及其生理状态14天,逐只检查接种部位变化,称重、扭颈致死后分别检查主要脏器,对疫苗安全性作出评估。

3.3
鸡新城疫母源抗体监测结果与其它报道的异同许多学者对新城疫母源抗体的消长规律进行了相关研究,其变化趋势主要有下坡势、单峰势和双峰势3类

传染性支气管炎效力检验:将14日龄的健康非免疫雏鸡20只,随机分为两组,每组10只,1组为对照组,不接种疫苗,2组为试验组,每只鸡滴鼻接种1个使用剂量的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗。分别在免疫前、免疫后7、14天翅静脉采血,用β-微量血凝抑制试验测定血清中传染性支气管炎的抗体水平。14天后将所有鸡用10倍稀释的IBM41强毒滴鼻,每只鸡1~2滴,观察10~14天,并计算免疫鸡的保护率和未免疫对照鸡的发病死亡率。

单剂量接种对蛋鸡产蛋性能的影响
取180日龄SPF蛋鸡60只随机分为30只/组,一组使用200701批疫苗进行免疫,肌肉注射,0.5毫升/只,另一组不免疫做对照。接种后,每天观察鸡只精神状态,全身反应,统计每天产蛋量,直至免疫后14天,对疫苗安全性作出评估。

鸡新城疫,是由副粘病毒属的新城疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,其发病后主要特征是呼吸困难、下痢、粘膜…

疫苗的效力检验
新城疫效力检验:由下表2可见,对照组与试验组在试验前抗体水平差异不显着,在试验后7、14天,对照组与试验组相比,抗体水平差异极显着。攻毒试验结果显示,试验组100%保护,对照组100%死亡。由此可见,用试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗1个使用剂量免疫接种14日龄雏鸡,7天可产生免疫力,免疫后14天对鸡新城疫强毒攻击的保护率为100%,说明该疫苗对预防雏鸡新城疫的发生是有效的。

疫苗中含灭活的鸡新城疫病毒La
Sota株、传染性支气管炎病毒M41株、减蛋综合征病毒Z16株和H9亚型禽流感病毒Hp株,灭活前鸡新城疫病毒含量≥4×108EID50/0.1毫升,传染性支气管炎病毒含量≥4×106.0EID50/0.1毫升,减蛋综合征病毒含量≥4×106.0TCID50,H9亚型禽流感病毒含量≥4×107EID50/0.1毫升。

1.2.2抗体检测采用血凝一血凝抑制试验技术,按照国标《新城疫诊断技术》所规定的方法操作,以检测不同Et龄蛋雏鸡的抗体效价。同时按常规方法设置阴性和阳性对照。

鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗、硫乙醇酸盐培养基、改良Frey培养基,由本课题组制备。

一次超剂量安全试验
选择3批疫苗随机抽取样品后,每批分别颈部皮下和胸肌肌肉注射接种1毫升于14日龄SPF鸡20只,同时取5只不接种作为对照组,各组别接种后分别置于负压隔离器内饲养,每天观察试验鸡只饮食及其生理状态,连续14天,逐只检查接种部位变化,称重、扭颈致死后分别检查主要脏器,对疫苗安全性作出评估。

3.1
鸡新城疫母源抗体整体水平通过对新城疫母源抗体水平监测,对该鸡场的免疫情况有了初步了解,新城疫母源抗体持续期为12d,母源抗体效价在3~101092范围内,整体水平较高,在l~11日龄时抗体效价均已达到合格标准,对蛋雏鸡有较高的免疫保护力。

疫苗的无菌检验
经观察,接种疫苗的硫乙醇酸盐培养基斜面小管及对照管在5天内均无细菌生长。

结果表明,无论是一次单剂量接种、单剂量重复接种还是一次超剂量接种,在整个试验观察期间,均未发现有试验鸡出现全身不良反应,鸡只精神状态、采食、增重未受严重影响。以1个使用剂量免疫180日龄产蛋SPF鸡,观察期内未出现全身或局部不良反应,14日内产蛋量与未免疫组无差异。

1.2.3
结果判定以100%抑制凝集的血清最大稀释度为该份血清样品的抗体效价;根据抗体水平低于51092时保护力很差,容易感染新城疫病毒而发病的基本理论,本试验把抗体水平51092作为保护临界值来评价免疫效果,当鸡HI抗体水平低于51092时,免疫效力低下,判断为免疫不合格;当HI抗体水平高于51092时,免疫效力良好,判断为免疫合格。

弱毒冻干疫苗的剩余水分含量测定结果

用途:该四联苗主要用于预防鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、H9亚型禽流感,开产前成鸡免疫期为4个月。

1.1.2
试验动物同一批次蛋雏鸡5000羽,来源于开产3个月的蛋鸡群,由江苏某规模化蛋鸡场提供。保持相同饲养环境,随机抽取l、3、5、7、9、1l、13日龄雏鸡各30羽待检。其父母代按如下免疫程序进行多次免疫:4日龄,饮水免疫鸡新城疫一传染性支气管炎二联活疫苗;25
13龄饮水免疫鸡新城疫一传染性支气管炎二联活疫苗;6013龄和90
13龄先后饮水免疫鸡新城疫活疫苗;120日龄肌肉注射接种鸡新城疫一传染性支气管炎一减蛋综合征三联灭活疫苗。

疫苗的免疫期测定
用20只14日龄的非免疫健康雏鸡,每只颈部皮下注射鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗0.2毫升,于免疫后第14天开始,每间隔14天用β-微量血凝抑制试验测定血清中新城疫、传染性支气管炎的抗体滴度,用AGP法测定传染性法氏囊抗体阳性率,直至血清抗体水平降至公认的保护抗体水平。

试验结果表明:疫苗免疫后7、14、21、35、42、60、90、120天新城疫、减蛋综合征、禽流感的平均HI抗体水平分别在1:64、1:256、1:64以上,传染性支气管炎的ELISA抗体不低于2.2,攻毒保护率在90%以上。

3.4鸡新城疫首免日龄的推定母源抗体水平在很大程度上影响着疫苗首免的效果,如果为止早期感染新城疫就盲目进行超前免疫,在母源抗体水平较高时进行首免,免疫后机体会受母源抗体的干扰,抑制体内抗体的产生,反而达不到免疫效果;如果在雏鸡母源抗体水平较低时再进行首免,此时雏鸡已出现了免疫空白,极易感染新城疫病毒。因此,从本次试验来看,对于该规模化蛋鸡场,建议新城疫疫苗首免时间安排在11~13日龄为宜,既可避开母源抗体的高峰期,又不会迟于母源抗体低于保护的临界值。

表1 鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联

一次单剂量安全试验
选择3批疫苗随机抽取样品后,每批分别颈部皮下和胸肌肌肉注射接种0.5毫升于14日龄SPF鸡10只,同时取5只不接种鸡,作为对照组,各组别接种后分别置于负压隔离器内饲养,每天观察试验鸡只饮食及其生理状态,连续14天,逐只检查接种部位变化,称重、扭颈致死后分别检查主要脏器,对疫苗安全性作出评估。

  1. 讨论

4.制备的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗在-25℃下可保存12个月,免疫后产生的抗体水平变化不大,因而认为其保存期限为12个月。参考文献略

二、主要成分与物理性状

  1. 结果

作者简介:刘瑞生,男,硕士,助理研究员,从事畜禽疾病防治研究工作

该疫苗外观为乳白色乳剂,油包水型。

1.1.1
试剂鸡新城疫病毒血凝一血凝抑制反应相关试剂,由南京市畜牧兽医站提供。

传染性支气管炎效力检验:由表3可见,对照组与试验组在试验前抗体水平差异不显着,在试验后7、14天,对照组与试验组相比,抗体水平差异极显着。攻毒试验结果显示,试验组100%死亡。由此可见,用试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗1个使用剂量免疫接种14日龄雏鸡,7天可产生免疫力,免疫后14天对鸡传染性支气管炎强毒攻击的保护率为100%。从而说明该疫苗对预防雏鸡传染性支气管炎的发生是有效的。

用法用量:开产前一个月左右,颈部皮下或肌肉注射,种鸡、蛋鸡每只免疫0.5毫升。

冠亚体育平台,1.2.1 样品采集雏鸡分别于1、3、5、7、9、11、13日龄采血,分离血清待测。

疫苗免疫期测定
由下表5可见,用三联弱毒冻干疫苗免疫14日龄小鸡后,14~28天抗体效价逐渐升高,42天后开始逐渐下降,至70天时仍可检测到较高水平的的抗体。表明试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗的免疫期最少为60天。

H9亚型禽流感部分
取28日龄SPF鸡15只,其中10只各颈部皮下注射疫苗0.3毫升,另5只不接种,作为对照,21天后,分别采血、分离血清,用H9亚型HP株禽流感抗原测定HI抗体效价。免疫鸡HI抗体几何平均滴度不低于1∶64,对照鸡HI抗体效价不高于1∶4。

2.1
蛋雏鸡母源抗体检测结果本试验共检测了210份雏鸡血清样品,如表1所示。新城疫母源抗体检测结果显示蛋雏鸡新城疫母源抗体水平在3日龄时平均效价最高,在13日龄时其新城疫母源抗体平均效价最低。其中抗体效价≥51092的羽数占总检测鸡群的91.4%

2.疫苗的安全检验直接关系到疫苗的应用,本试验使用10个使用剂量的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗免疫雏鸡,雏鸡在精神状况、饮食欲等均无异常表现,说明该疫苗在鸡上使用无毒力返强现象,对14日龄以上鸡无毒副作用,安全性好。

鸡减蛋综合征部分
用21~42日龄SPF鸡10只,每只肌肉或皮下注射疫苗0.5毫升,另取SPF鸡10只作对照。21~35天后,分别采血、分离血清、测定HI抗体效价。免疫鸡HI抗体效价几何平均滴度不低于1∶128,对照鸡HI抗体效价不高于1∶4。

3.2鸡新城疫母源抗体随雏鸡日龄变化检测结果显示,新城疫母源抗体效价随着雏鸡日龄的增长而呈缓慢下降趋势。已接种新城疫疫苗的母鸡,其体内的免疫抗体能够通过卵黄囊传递给雏鸡,而使雏鸡产生被动免疫力,1日龄雏鸡母源抗体水平已高于保护临界值,由于雏鸡获得母源抗体是通过卵黄的吸收实现的,而雏鸡对卵黄的吸收有一定过程,因此在3—5日龄时雏鸡的母源抗体水平较1日龄时有所上升,母源抗体水平从7日龄开始下降,直到13日龄时抗体效价降至保护临界值以下,此时母源抗体水平已达不到保护力。

真空度检验 用高频火花真空测定器照射疫苗瓶,看是否出现紫色辉光。

鸡传染性支气管炎部分
用14~42日龄SPF鸡20只,各点眼接种鸡传染性支气管炎活疫苗1羽份,接种后21~28天分别采血、分离血清,同时再各接种本疫苗0.5毫升,二次接种后21~28天分别采血、分离血清。将两次血清分别作HI抗体效价测定。二免血清HI抗体效价的几何平均值较首免血清HI抗体效价的几何平均值高3倍以上。

安全性检验
每批疫苗随机抽取4支,稀释后充分混合,给30只14日龄雏鸡颈部皮下注射接种10个使用剂量,观察14天,看有无异常反应。

鸡新城疫部分
采用血清学方法进行检验,用30~60日龄SPF鸡15只,10只各皮下或肌肉注射疫苗20微升,另5只作对照。接种后21~28天,对每只鸡分别进行采血、分离血清,进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值不低于1∶16,对照组HI抗体效价的几何平均值不高于1∶4。

笔者采用鸡胚尿囊腔同胚培养新城疫Lasota株和传染性支气管炎H120株,鸡胚成纤维细胞旋转立体培养传染性法氏囊B87,将收获的含毒鸡胚尿囊液和细胞毒液通过配制比例筛选混合冻干,制备成鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗,为了了解该疫苗的各项性能,特进行了疫苗的检测试验。

临床保护试验
在河南、山东、河北等不同区域对不同年龄、性别、品种的鸡接种该疫苗10余万羽,免疫后7、14、21、35、42、60、90、120天分别随机抽取10只免疫鸡,检测新城疫、减蛋综合征、禽流感的HI抗体水平以及传染性支气管炎的ELISA抗体水平,并进行攻毒。

倘若在观察期内,如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化,pH值变化达±0.5时,应立即移植于小管液体培养基和固体培养基上,观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化,及固体培养基上有无典型的煎蛋状支原体菌落。

传染性法氏囊效力检验:由下表4可见,对照组与试验组在试验前传染性法氏囊的抗体阳性率差异不显着,在试验后7、14天,对照组与试验组相比,抗体阳性率差异极显着。攻毒后72小时的剖检结果为,试验组10只鸡中7只法氏囊无任何肉眼可见变化,3只鸡的法氏囊有不同程度的病变,因而该疫苗的保护率为70%;而对照组10只鸡法氏囊全部不同程度的表现为:法氏囊体积和重量均增大,囊壁增厚,发黄,黏膜表面有点状出血或瘀血性出血,囊表面覆有一层胶胨样黄色渗出液,并有纵行条纹,囊腔内充满混浊粘液和干酪样渗出物,即100%发病。说明试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗对预防鸡传染性法氏囊的发生有较好的作用。表4
传染性法氏囊效力检验结果

疫苗的效力检验
新城疫效力检验:将14日龄的健康非免疫雏鸡20只,随机分为两组,每组10只,1组为对照组,不接种任何疫苗;2组为试验组,每只鸡滴鼻接种1个使用剂量的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗。分别在免疫前、免疫后7、14天翅静脉采血,用β-微量血凝抑制试验测定血清中新城疫的抗体水平。14天后将所有鸡用10000ELD50的新城疫F48E9强毒肌肉注射1毫升/只,观察10~14天,并计算免疫鸡的保护率和未免疫对照鸡的发病死亡率。

3.效力检验是验证疫苗应用效果的关键,本试验采用雏鸡检验疫苗的效力方法,对14日龄非免疫雏鸡注射鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗后,在鸡体内能产生较高的抗体水平,抵抗新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性法氏囊强毒的攻击,说明该疫苗的3种抗原在鸡体内均产生了较强的免疫应答反应,达到接种1次有效预防鸡新城疫、传染性支气管炎和传染性法氏囊三种传染病的发生。

新城疫F48E9强毒、传染性支气管炎M41强毒和传染性法氏囊BC6-85强毒,购自中国兽医药品监察所。

物理性状观察
疫苗经冻干后,观察其颜色、疏松度,是否能与瓶壁脱落,加稀释液后的溶解度如何。

疫苗保存期测定
从下表6可见,试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗在-25℃保存1、4、7、9和12个月,免疫接种14日龄小鸡后14天产生的新城疫抗体效价分别为7.5、7.4、7.4、7.2和7.3;传染性支气管炎的抗体效价分别为7.3、7.4、7.2和7.0;传染性法氏囊抗体阳性率分别为80%、70%、80%、70%和70%,免疫力下降程度不大,差异不显着。因此,鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊D三联弱毒冻干疫苗在-25℃的保存期至少为1年。

1.将新城疫Lasota、传染性支气管炎H120和传染性法氏囊B87三种抗原按一定比例配比制备的鸡三联弱毒冻干疫苗,在物理性状、无菌检验、支原体检验、剩余水分含量测定、真空度检验方面合格,符合《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》。

传染性法氏囊效力检验:将14日龄的健康非免疫雏鸡20只,随机分为两组,每组10只,1组为对照组,不接种疫苗,2组为试验组,每只鸡滴鼻接种1个使用剂量的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗。分别在免疫前、免疫后7、14天翅静脉采血分离血清,用AGP法测定传染性法氏囊抗体阳性率,20天后取全部免疫鸡连同对照鸡,每只点眼攻击50个发病量的传染性法氏囊BC6-85强毒0.05毫升,72小时后剖杀所有鸡,检查法氏囊的变化。

疫苗的剩余水分含量测定
从下表1可以看出,试制的3批鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗剩余水分含量均未超过4%,合乎国标要求。

疫苗的真空度检查
用高频火花真空测定器测定,3批疫苗瓶内均出现紫色辉光,说明真空度检验合格。

疫苗的保存期测定
试制的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗经物理性状观察和实验室检验合格后,于-25℃冷冻保存;每间隔3个月免疫14日龄雏鸡10只,同时另设对照10只,于免疫后14天采血分离血清,检测鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊的抗体水平,确定该疫苗的保存期。

物理性状观察
冻干后的疫苗均呈微红色海绵状疏松团块,易与瓶壁脱离,加稀释液后能迅速溶解。

表3 传染性支气管炎效力检验结果

支原体检验
每批冻干疫苗随机抽取4支,用灭菌生理盐水稀释至原量,混合后将5毫升疫苗混合物接种于小瓶改良Frey培养基,再从小瓶中取0.2毫升移植接种于1小管液体培养基内,将小瓶与小管同时37℃培养,每日观察培养物颜色变化。若在5~7天尚未见变化,再从小瓶中取0.2毫升移植于另1管液体培养基内,置37℃继续培养观察5~7天,如此重复3次,若无变化,在最后一次接种小管的培养物观察14天后停止观察。

免疫期测定结果表明,应用鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联弱毒冻干疫苗免疫14日龄雏鸡后,14~42天d抗体效价高,免疫效果好。此后抗体效价降低,免疫效果减弱,但仍具有一定保护力,免疫期限为60天左右。

疫苗的支原体检验
在3次7天的反复培养和最后一次14天的培养中,小瓶和小管内的培养基颜色均无变黄或变红的现象,说明试制的3批疫苗均无支原体污染。

新城疫和传染性法氏囊病三种传染病通常采用相应的单苗进行多次免疫,不仅费工费时,频繁免疫
接种还会引起鸡的应激反应。目前,国外已研制出鸡新城疫、传染性支气管炎和传染性法氏囊三联弱毒疫苗。近年来,国内也开展了这方面的研究工作,由于各地采用的毒株不同,制备工艺不同,病毒的培养方式也不一样,制备的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊三联疫苗对鸡的免疫效果也不一样。

计算公式:含水量%=/干前重×100

相关文章